3). Fusi Protoplas

·                     Fusi protoplas merupakan suatu proses alamiah yang terdapat darimulai tanaman tingkat rendah sampai pada tanaman tingkat tinggi.

·                     Fusi protoplas merupakan gabungan protoplas dengan protoplas lain dari beberapa spesies, kemudian membentuk sel yang dapat tumbuh menjadi tanaman hibrid.

·                     Hibridisasi somatik melalui fusi protoplasma digunakan untuk menggabungkan sifat lain dua spesies atau genus yang tidak dapat digabungkan secara seksual ataupun aseksual.

·                     Hal ini dapat dilakukan dengan cara menggabungkan seluruh genom dari spesies yang sama (intra-spesies), atau antarspesies dari genus yang sama (inter-spesies), atau antargenus dari satu famili (inter genus).

Protoplas dari dua sel yang mulai bergabung

·                     Ketika tanaman dilukai, maka sejumlah sel yang disebut callus akan tumbuh pada tempat yang dilukai tersebut.

·                     Sel-sel callus memiliki kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi tunas dan akar serta keseluruhan tanaman berbunga.

·                     Potensi alami sel-sel tersebut yang terprogram menjadi calon tanaman baru sangat ideal untuk rekayasa genetik. Seperti pada sel-sel tanaman, sel-selcallus dikelilingi oleh dinding selulosa yang tebal, yaitu sebuah rintangan yang menghambat pembentukan DNA baru.

·                     Dinding sel tersebut dapat dipecah dengan dinding selulose sehingga menghasilkan sel tanpa dinding sel yang disebut protoplas.

·                     Protoplas ini dapat digabungkan dengan protoplas lain dari beberapa spesies, kemudian membentuk sel yang dapat tumbuh menjadi tanaman hibrid.

·                     Metode ini disebut fusi protoplas.

·                     Tujuan fusi protoplas adalah untuk mendapatkan suatu hibrida somatic atau sibrida atau mengatasi kelemahan dari hibrida seksual.

Terdapat kelemahan dari hibrida seksusal, yaitu:

·                     Sukar untuk mendapatkan suatu hibrida antar spesies dan antar genera.

·                     Hibridisasi somatik dapat mengatasi hal tersebut.

·                     Sitoplasma pada perkawinan seksual hanya berasal dari induk betina saja.

·                     Dalam proses pembuahan, ganet jantan hanya membawa inti saja dengan sedikit sitoplasma sebaliknya pada tetua betina selain inti juga sitoplasma.

·                     Untuk mendapat sitoplasma dari kedua tetua diadakan fusi antara sitoplasma.

·                     Fusi protoplas dapat dimanfaatkan untuk melakukan persilangan antar spesies atau galur tanaman yang tidak memungkinkan untuk dilakukan dengan persilangan biasa karena adanya masalah inkompatibilitas fisik.

Fusi protoplas membuka kemungkinan untuk:

1.          Menghasilkan hibrid somatik amphidiploid yang fertil antar spesies yang secara seksual tidak kompatibel

2.          Menghasilkan galur heterozigot dalam satu spesies tanaman yang secara normal hanya dapat diperbanyak dengan cara vegetatif, misalnya pada kentang.

3.          Memindahkan sebagian informasi genetik dari satu spesies ke spesies lain dengan memanfaatkan fenomena yang disebut penghilangan kromosom (chromosome elimination).

4.          Memindahkan informasi genetik yang ada di sitoplasma dari satu galur atau spesies ke galur atau spesies lain

Fusi protoplas dapat menghasilkan dua macam kemungkinan produk:

1.          Hibrid, jika nukleus dari kedua spesies tersebut betul-betul mengalami fusi (menyatu)

2.          Cybrid (cytoplasmid hybrid ataru heteroplast), jika hanya sitoplasma yang mengalami fusi sedangkan informasi genetik dari salah satu induknya hilang.

3.          Teknik ini memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihan dari teknik ini adalah dapat menghasilkan tanaman dengan sifat tertentu dan dapat dilakukan dengan spesies yang berbeda. Kekurangan dari teknik ini adalah memerlukan biaya yang mahal serta butuh ketelitan yang lebih.

Skema fusi protoplas dalam menghasilkan produk

4). Teknik Potongan Daun (Leaf Fragment Technique)

·                     Transfer genetik terjadi secara alami pada tanaman dalam merespon organisme patogen. Contohnya, suatu luka dapat terinfeksi oleh bakteri tanah yang disebut Agrobacterium tumefaciens (Agrobacter).

·                     Bakteri ini memiliki plasmid yang besar (molekul DNA double helix yang sirkuler) yang dapat merangsang sel-sel tanaman untuk tumbuh terus-menerus tanpa terkontrol (tumor).

·                     Oleh karena itu, plasmid ini dikenal sebagai Tumor inducing (Ti) plasmid.

·                     Sedangkan hasil dari tumor tersebut disebut crown gall.

·                     Selama infeksi, bakteri ini mentransfer sebagian kecil materio genetik yang dimilikinya (T-DNA) ke dalam genom sel tanaman inang.

·                     Setelah diinsersi, gen-gen bakteri tersebut diekspresi oleh sel-sel tanaman yang terinfeksi.

Mekanisme penggabungan gen melalui teknik potongan daun

·                     Plasmid bakteri memberi gagasan bagi para ahli bioteknologi sebagai sarana transfer DNA.

·                     Dalam penggunaannya, peneliti sering menyebut sebagai teknik potongan daun.

·                     Dalam teknik ini daun dipotong kecil-kecil kemudian ketika potongan daun mulai regenerasi, selanjutnya akan dikultur pada medium yang mengandung Agrobacter yang telah mengalami modifikasi genetik.

·                     Selama proses ini, DNA dan Ti plasmid berintegrasi ke DNA sel inang dan materi genetik pun telah terkirim.

·                     Potongan daun tersebut kemudian diberi hormon untuk merangsang pertumbuhan tunas dan akar.

·                     Kekurangan utama dari proses ini adalah Agrobacter tidak dapat menginfeksi tanaman monokotil seperti jagung dan gandum.

·                     Tanaman dikotil seperti tomat, kentang, apel, juga kedelai merupakan contoh yang cocok untuk proses ini.

·                     Namun penelitian baru-baru ini jelas menunjukkan bahwa T-DNA dapat digabungkan ke dalam spesies monokotil.

·                     Untuk bakteri yang tahan terhadap Agrobacter dilakukan dengan menggunakan pistol gen, yaitu dengan cara menembakkan logam kecil yang diselubungi DNA ke embrio sel tumbuhan, di sini inti sel tumbuhan tetap bisa membidik kloroplas.

·                     Kelebihan dari teknik ini adalah dapat menghasilkan tanaman dengan sifat yang sesuai dengan keinginan.

5). Teknik Kultur Invitro

·                     Kultur invitro merupakan salah satu teknik yang dapat dilakukan untuk meningkatkan keragaman genetik tanaman, antara lain dengan keragaman somaklonal (Pedrieri, 2001).

·                     Menrut Ahlowalia (1986), perubahan genetik dapat terjadi selama periode kultur invitro atau karena adanya sel-sel yang mengalami mutasi.

·                     Perbanyakan tanaman dengan kultur invitro telah banyak diusahakan secara komersial di negara maju seperti Amerika, Jepang, dan Eropa..pemanfaatan lain teknologi tersebut untuk pengadaan bibit pada awalnya berdasarkan hasil percobaan Morel tahun 1960 pada anggrek Cymbidium.

Langkah-langkah kultur invitro

·                     Dalam waktu yang singkat dari bahan tanaman yang sangat terbatas dapat dihasilkan bibit dalam jumlah yang banyak dan memiliki sifat yang sama dengan induknya.

·                     Keberhasilan tersebut mendorong dimanfaatkannya in vitro sebagai teknologi perbanyakan yang banyak memberikan keunggulan daripada teknologi konvensional.

Walaupun demikian terdapat beberapa kendala yang sering dihadapi dalam aplikasinya yaitu:

1.          Keberhasilan teknik ini pada tanaman tahunan berkayu masih rendah sehingga aplikasinya masih terbatas pada jenis tanaman tertentu saja.

2.          Kapasitas egenerasi menurun bila sering melakukan pembaharuan

3.          Penurunan integritas genetik pada bibit yang dihasilkan

4.          Persentase keberhasilan aklimatisasi (terutama pada tanaman tahunan berkayu) relatif masih rendah

5.          Adanya patogen internal (khususnya pada tanaman tahunan berkayu) yang sulit dihilangkan

6.          Diperlukan tenaga kerja yang intensif, terdidik, serta mempunyai keterampilan khusus

7.          Diperlukan modal awal yang cukup tiggi

Pierik dalam.Nurwandani, Paristiyanti: 2008 menyatakan bahwa perbanyakan melalui kultur invitro dapat dikatakan berhasil bila memenuhi beberapa kriteria sebagai berikut:

1.          Tidak merubah sifat genetik poon induk

2.          Seleksi kuat pada bahan tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan agar bebas penyakit

3.          Teknik perbanyakan yang tidak terlalu rumit

4.          Kemampuan regenerasi yang tetap tinggi

5.          Ekonomis

·                     Padatanaman semusim (berdinding lunak),masalah regenerasi umumnya tidak menjadi masalah.

·                     Faktor pertunasan yang tinggi dapat tercapai dengan penggunaan formulasi media tertentu.

Berbeda degan tanaman tahunan berkayu,banyak faktor yang menghambat proses regenerasi, antara lain:

1.          Daya meristematis yang rendah

2.          Tingkat oksidasi fenol yang tinggi

3.          Jaringannya sklerenkhima

4.          Kandungan inhibitor organik yang tinggi

5.          Kurangnya faktor perakaran

6.          Kandungan lignin yang tinggi, dan

7.          Gugurnya tunas daun yang lebih dini